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内标定量与外标定量比照 ？

2016-07-07 16:23
  由于古板定量要领都是终点检测 ，即PCR抵达平台期后举行检测 ，而PCR经由对数期扩增抵达平台期时 ，检测重现性极差。统一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验 ，所得效果有很大差别 ，因此无法直接从终点产品推算出起始模板量。加入内标后 ，可部分消除终产品定量所造成的禁绝确性。但纵然云云 ，古板的定量要领也都只能算作半定量、简陋定量的要领。  内标定量：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标 ，则PCR反应变为双重PCR ，他们之间保存两种模板之间的滋扰和竞争 ，尤其当两种模板的起始拷贝数相差较量大时 ，这种竞争会体现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的 ，以是无法加入合适数目的已知模板作为内标 ，也正是这个缘故原由 ，古板定量要领虽然加入内标 ，但仍然只是一种半定量的要领。  外标定量：外标法不是把标准物质加入到被测样品中 ，而是与被测样品在相同条件下举行检测。由于在荧光定量PCR中 ，Ct值与起始模板的对数保存线性关系 ，因此可以使用标准曲线对未知样品举行定量测定 ，并且在PCR循环刚刚进入真正的指数扩增期时 ，Ct值的重现性极好 ，即统一模板差别时间扩增或统一时间差别管内扩增 ，获得的Ct值是恒定的 ，因此定量的效果也会准确许多。  美国Texas大学的科研职员举行了外标法定量和内标法定量的要领学较量 ，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的 ，而外标准曲线的定量要领是一种准确的、值得信任的科学要领。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】
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